■   知識點

      His標簽蛋白哺乳動物細胞

無血清培養(yǎng)表達和純化      

·  轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

      隨著生物制藥和細胞治療產(chǎn)品的需求不斷增加，利用無血清細胞培養(yǎng)技術(shù)表達和純化單克隆抗體及抗原等各種類型重組蛋白的技術(shù)已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用，珠海愷瑞擁有完整的哺乳動物細胞無血清培養(yǎng)重組蛋白表達和純化試劑及技術(shù)，可幫助客戶實現(xiàn)各種重組蛋白的哺乳動物細胞無血清培養(yǎng)表達和純化。

·  蛋白表達及純化

       重組蛋白的細胞表達需要先構(gòu)建蛋白表達質(zhì)粒，然后選擇合適的細胞例如HEK293或CHO細胞，使用PEI等化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑或電轉(zhuǎn)儀將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)來實現(xiàn)蛋白在細胞內(nèi)的表達。

      單克隆抗體的表達除了可以使用重組基因表達方法以外，還可以通過對雜交瘤細胞的無血清懸浮培養(yǎng)來獲得高效表達。重組單克隆抗體及雜交瘤細胞單抗的純化主要依靠蛋白A親和層析實現(xiàn)，方法簡單可靠，較少出現(xiàn)技術(shù)問題。

      其它類型的重組蛋白純化較多使用蛋白標簽親和層析法，通過在蛋白一端連接一段蛋白標簽和使用標簽蛋白特異結(jié)合填料來完成重組蛋白的純化，其中His標簽和相對應(yīng)的鎳填料層析可能最為常用。

·  His標簽蛋白

      His標簽蛋白組氨酸咪唑環(huán)可特異結(jié)合層析填料中的鎳金屬，并可利用咪唑競爭洗脫下來。His標簽蛋白的純化基本操作流程為：柱平衡、上樣、洗雜、洗脫、柱再生。將樣品調(diào)節(jié)至與平衡液相同的 pH，先后用5CV100%洗脫液及平衡液進行平衡，平衡完畢后進行上樣。洗雜時可使用5%洗脫液進行競爭洗雜，洗去一些結(jié)合不牢的雜蛋白成分，再使用100%洗脫液將目的蛋白洗下收集，最后用5CV洗脫液及5CV平衡液再生柱子。

·  純化His標簽蛋白時較易出現(xiàn)各種技術(shù)問題

    1.如果洗脫組分不純，可增加洗雜液的體積、調(diào)節(jié)pH及咪唑濃度、增加一步純化如離子交換疏水層析等。或?qū)悠愤M行初步純化如AS或PEI沉淀后再利用親和層析完成純化過程；

    2.若洗脫組分中無目的蛋白或蛋白量過低，可通過Western Blotting方法對His標簽蛋白表達和純化樣品進行定性和定量分析。如果蛋白表達量過低，則可嘗試改變和優(yōu)化表達條件來提高產(chǎn)量；如果蛋白表達量正常但是純化效果不佳，則可嘗試降低洗雜液濃度、提高洗脫液濃度以防止結(jié)合較弱或過強的目的蛋白的損失；

    3.倘若上樣過程中出現(xiàn)蛋白沉淀現(xiàn)象，則可能是操作溫度太低，可以待樣品恢復(fù)至室溫后上樣。也可考慮在樣品或緩沖溶液中添加穩(wěn)定劑。

        純化后的樣品可通過SDS-PAGE凝膠電泳等方法對蛋白純度及分子量進行測定。為了避免反復(fù)凍融對蛋白造成的影響可將純化后的蛋白除菌后，分裝成小份，按需取用，或使用冷凍干燥等方法將蛋白長期保存。

本文轉(zhuǎn)自公眾號：珠海愷瑞