支原體污染一般會呈現(xiàn)細胞狀態(tài)變差、生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會有小黑點，但培養(yǎng)基一般不渾濁，細胞傳代以后就出現(xiàn)細胞間黑點、細胞空泡化或者很多類似凋亡、壞死的細胞，最終細胞漂浮，完全死亡。

支原體污染需要實驗室及培養(yǎng)箱進行滅菌處理，實驗室環(huán)境可采用84消毒以及臭氧，培養(yǎng)箱用酒精進行擦拭后再使用，再有就是操作及使用的耗材，像移液槍及移液管在使用上需要注意。

建議細胞使用3個月后更換（傳代20次左右），不斷利用同一株細胞，細胞會不斷衰老，對實驗效果不佳。

此現(xiàn)象是正常的，細胞可能處于分裂階段，會出現(xiàn)呈葡萄的黏連現(xiàn)象，若細胞出現(xiàn)致密的球狀結(jié)團，則細胞活率可能會下降，注意檢查各培養(yǎng)條件是否正常，如搖床轉(zhuǎn)數(shù)是否過高，細胞傳代是否不及時等。

一般培養(yǎng)基中大多數(shù)使用HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO₃的含量決定細胞培養(yǎng)時CO₂的濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO₃含量為每公升3.7g時，采用10%CO₂；培養(yǎng)基中NaHCO₃含量為每公升1.5g時采用5%CO₂。

若使用珠海愷瑞的凍存液KD-Freeze，解凍復(fù)蘇時無需離心去除DMSO；

若使用自配的凍存液，可離心去除DMSO再進行用新鮮培養(yǎng)液重懸細胞；或直接培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)液中，待隔天置換新鮮培養(yǎng)液以去除DMSO（可避免大部分解凍后細胞無法生長或離心對細胞造成物理性傷害以及細胞流失）。

細胞復(fù)蘇不起來時首先要檢查培養(yǎng)件是否有誤，如溫度37℃；濕度穩(wěn)定；搖床轉(zhuǎn)速120rpm(振幅為26mm，若振幅為50mm，則換算轉(zhuǎn)速為85-90rpm)；其次，細胞凍存時的狀態(tài)是否穩(wěn)定；或復(fù)蘇時水浴溫度距37℃上下差距較大或水浴時間過長，另外凍存時間過長對細胞也有一定的損傷，凍存液中的成分對細胞生長也有較輕的抑制效果。

出現(xiàn)復(fù)蘇1-2代細胞活率逐漸下降，此時可以先把細胞轉(zhuǎn)至方瓶放置靜止培養(yǎng)箱，再觀察狀態(tài)；待細胞狀態(tài)回復(fù)后，重新轉(zhuǎn)搖瓶培養(yǎng)。

進行細胞種子保存時，請按說明書中推薦的細胞凍存密度將細胞離心，再加入珠海愷瑞自主研發(fā)的無血清細胞凍存液，而后依次放置于-80℃冰箱和液氮罐保存。細胞復(fù)蘇時不需要對融化后的細胞進行離心除去細胞凍存液這一步操作，直接將細胞轉(zhuǎn)移到小體積搖瓶進行懸浮培養(yǎng)，待細胞恢復(fù)三至四天后進行傳代，細胞活率恢復(fù)后再進行后續(xù)實驗，避免造成對后續(xù)實驗的影響。

細胞傳代培養(yǎng)時需要注意選擇細胞的傳代接種密度、傳代時機以及密切關(guān)注細胞活率等事項。以珠海愷瑞馴化篩選的HEK293為例，此細胞生長周期為9-10天，傳代時細胞接種密度為0.3-0.5×106個/毫升，細胞傳代時期是細胞正處于指數(shù)增長期，此時細胞活率應(yīng)在98%以上，細胞密度為4-6×106個/毫升（即培養(yǎng)三到四天進行傳代）。傳代培養(yǎng)過程中要密切注意細胞的活率狀態(tài)，若活率下降，需先檢查各個培養(yǎng)條件是否發(fā)生了變化，若無，則對細胞進行離心處理，在小體積搖瓶中傳代培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)恢復(fù)后再進行下一步實驗。

珠海愷瑞開發(fā)的無血清化學限定培養(yǎng)液采用自主研發(fā)配方，且不含抗結(jié)團劑及其它蛋白添加因子，所提供的細胞生長環(huán)境與其它品牌產(chǎn)品明顯不同，因此在更換培養(yǎng)液時細胞容易出現(xiàn)短暫的不適應(yīng)現(xiàn)象。用戶在更換使用珠海愷瑞培養(yǎng)液時若出現(xiàn)上述現(xiàn)象，可將新、舊培養(yǎng)液混合后使用并逐步減低原來培養(yǎng)液體積比例，待細胞過渡到新培養(yǎng)液后，讓細胞在新的培養(yǎng)液中持續(xù)傳代數(shù)周時間，等細胞的生長速度及密度恢復(fù)至正常狀態(tài)再做下一步的實驗。在此期間，我們會安排技術(shù)人員及時解答用戶所遇到的問題，確保細胞培養(yǎng)的成功。

不需要，珠海愷瑞開發(fā)的無血清細胞培養(yǎng)基系列均不需要提前預(yù)熱，4℃冰箱中取出即可直接使用，不會對細胞造成損害導致大面積死亡。

不可以進行紫外照射，在紫外照射下，部分營養(yǎng)添加劑/細胞因子中蛋白成分會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變，降低使用效果或?qū)毎a(chǎn)生毒性；培養(yǎng)基經(jīng)紫外線照射，其中營養(yǎng)成分可能發(fā)生改變，如某些氨基酸發(fā)生化學活化，對細胞產(chǎn)生毒性，影響細胞正常生長。

若轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)松散的細胞結(jié)團現(xiàn)象，可能是細胞成團粘附于瓶壁上并在震動中脫落下來所致，這種情況多數(shù)是搖瓶本身不干凈或細胞存活率低而引起。在轉(zhuǎn)染后，若轉(zhuǎn)染后細胞結(jié)團現(xiàn)象比較嚴重，可在轉(zhuǎn)染1天后加入適量抗結(jié)團劑（例如25mg/L左右的硫酸葡聚糖），以緩解或消除細胞結(jié)團。

因本系統(tǒng)使用的方法為高細胞密度轉(zhuǎn)染，在20×10⁶個/ml密度條件下培養(yǎng)可能會出現(xiàn)輕微掛壁情況，這屬于正常情況，可繼續(xù)進行下一步操作。

質(zhì)粒提取一般選擇無內(nèi)毒素的大提試劑盒，內(nèi)毒素的含量越低越好，愷瑞非定制的培養(yǎng)基KOP293內(nèi)毒素含量低于10EU/ml。

質(zhì)粒濃度我們建議在1mg/ml，如果轉(zhuǎn)染密度在2x10⁶個/ml，這個質(zhì)粒濃度量是足夠的，如果用戶提高轉(zhuǎn)染密度，對應(yīng)的也可以適當調(diào)整質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑比例。常規(guī)轉(zhuǎn)染可按照我們推薦的濃度即可。超螺旋比例越高越好。

通常表達峰值在3-4天，這個期間如果細胞活率下降會很大影響得率，最優(yōu)的收樣條件在5-6天左右，活率在70-80%。

正常，收樣時的顏色差異主要與pH有關(guān)，導致這種的原因，主要還是要看當時的細胞狀態(tài)，細胞狀態(tài)不好就有可能偏酸，就算轉(zhuǎn)染同一個質(zhì)粒同一個細胞也會有這種情況發(fā)生；與質(zhì)粒也有關(guān)系。

根據(jù)不同質(zhì)粒的表達水平不同，293表達量大概在1-600mg/L，CHO表達量大概在1-400mg/L；在質(zhì)粒同等表達水平下，建議使用293系統(tǒng)表達；若在293系統(tǒng)表達下，表達量相對較低，建議使用Hi-KDCHO高密度瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)表達；Hi瞬轉(zhuǎn)表達比正常CHO瞬轉(zhuǎn)表達產(chǎn)量高10倍左右。

不是增強轉(zhuǎn)染，是增強蛋白表達。主要作用是延緩細胞分裂，抑制細胞快速生長，從而促進蛋白表達、增加蛋白產(chǎn)量。

KT-Feed對CHO及HEK293細胞都適用，是一種植物蛋白營養(yǎng)添加劑，可補充細胞所需營養(yǎng)提高細胞表達量；據(jù)本公司的實驗結(jié)果顯示：添加KT-Feed能提高1/3-1倍的表達量，但由于蛋白表達結(jié)果受多方面的因素影響（z細胞生長狀況、質(zhì)粒表達水平等），具體增加的蛋白表達結(jié)果視實際情況而定。

轉(zhuǎn)染試劑染的原理：不是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，我們的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染的。

經(jīng)多次驗證，使用珠海愷瑞的293細胞瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其最佳收樣時間為轉(zhuǎn)染后的第六天，但由于用戶表達的蛋白大小及性質(zhì)不盡相同，導致細胞轉(zhuǎn)染后存活時間長短不一，因此收樣時間應(yīng)視情況而定，建議收樣時細胞活率不要低于70%。

通常情況下細胞轉(zhuǎn)染之后活率不會有太大的降低，若出現(xiàn)細胞活率急劇下降，首先檢查培養(yǎng)條件是否有誤，其次需檢查所使用的轉(zhuǎn)染試劑量是否過量，過量的轉(zhuǎn)染試劑或者轉(zhuǎn)染復(fù)合物都會導致活率下降。

也可以，但建議把sp2/0馴化至無血清再做小鼠融合，以便后續(xù)雜交瘤細胞馴化難降低。

雜交瘤細胞在1%FBS條件下傳代1-2次，再進行降無血清。細胞在沒完全適應(yīng)低血清條件下生長，直接降無血清很難生長起來。

ITSplus與KD-HybriGro用途不同，ITSplus基礎(chǔ)添加因子，主要應(yīng)用于細胞無血清馴化及培養(yǎng)，在細胞克隆提高方面效果不明顯，KD-HybriGro含重組白介素組合因子，可明顯促進雜交瘤單細胞生長，配合1%FBS主要用于雜交瘤細胞單克隆培養(yǎng)，同時也可用于細胞馴化及融合培養(yǎng)。

KTM2是市面上1640、DMEM、IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良的低密度無血清培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分上與它們區(qū)別較大，更適宜在方瓶中培養(yǎng)雜交瘤細胞；

KD-Clone是單細胞克隆培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分比KTM2低，適合單細胞生長；適用于其他類型細胞克隆時的培養(yǎng)液。

KD-Hybri是高密度無血清培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分比其他兩種更復(fù)雜，適用于骨髓瘤/雜交瘤細胞生長。

ITSplus中含有骨髓瘤/雜交瘤細胞生長因子，但此因子穩(wěn)定性欠佳，不能直接事先配入KD-Hybri中。所以KD-Hybri添加了ITSplus細胞才能生長，單獨的KD-Hybri不能培養(yǎng)骨髓瘤/雜交瘤細胞。

細胞上搖瓶的原則是，先維持低濃度血清，不低于0.5×10⁶個/ml的密度上搖瓶，讓細胞在初次上搖瓶時，仍保持對數(shù)生長速度，細胞密度增加，活率變化不大之后，再在搖瓶中逐步降血清，這樣的成功率會比較高。

通常來說，可以直接用KD-Hybri代替DMEM，血清的濃度先維持不變，看細胞適應(yīng)后，在開始逐步減血清。

在擴增培養(yǎng)轉(zhuǎn)移細胞時，盡量在細胞生長狀態(tài)良好且細胞匯合度達到80%左右進行，匯合度過高或過低均不利于細胞擴增。

細胞傳代要及時并選擇對數(shù)生長期進行傳代。不同克隆的雜交瘤細胞生長速率不同，對無血清培養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)能力不同，最高生長密度也會有不同。

雜交瘤細胞穩(wěn)定性較差，無血清持續(xù)馴化過程中可能會引起陽性細胞丟失，若遇到這種情況可通過對細胞進行多次單克隆以提高其陽性特性。

進行無血清馴化時必須保證細胞狀態(tài)良好，細胞活率在85%以上時方可進行。切換成無血清培養(yǎng)后細胞一開始活率下降是細胞正在適應(yīng)無血清環(huán)境的正?，F(xiàn)象，此時需重點監(jiān)測細胞后續(xù)是否有增殖、活率是否在逐漸回升。若細胞活率低于50%應(yīng)補回2%血清，傳代2-3代，待細胞狀態(tài)恢復(fù)后再進行無血清馴化。

雜交瘤細胞一般可以直接從靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)換到搖瓶懸浮震蕩培養(yǎng)，在此過程中細胞需要先通過靜置培養(yǎng)逐級擴增，當細胞數(shù)量較多時再進行懸浮震蕩培養(yǎng)。細胞接種到搖瓶時請將培養(yǎng)液切換成KD-Hybri，此時培養(yǎng)基血清含量可降至2%。